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La produzione o sintesi chimica dei geni è un pilastro cruciale nella moderna biologia molecolare, poiché aiuta a produrre interi geni nativi e nuovi geni (quelli che non si trovano in natura). Inoltre, il processo costituisce la base per la produzione di interi genomi (l’insieme completo di istruzioni genetiche presenti in una cellula vivente).
I progressi nelle di sintesi genetica significano che diversi metodi di produzione genetica sono a disposizione delle parti interessate. Tuttavia, ogni metodo ha la sua applicazione di nicchia, sintetizzando geni specifici, e una tecnica non può sostituirne un'altra. Pertanto, di seguito è riportata una panoramica delle tecniche comuni di sintesi genetica e delle loro caratteristiche per guidare la scelta del metodo per diversi progetti.
La produzione di geni sintetici è un processo graduale che facilita la produzione di un gene e di altri prodotti genetici senza fare affidamento su uno stampo di DNA. Pertanto facilita la produzione di diversi geni, compresi geni personalizzati con sequenze o coppie di basi modificate.
Come affermato in precedenza, i progressi nella biotecnologia implicano l’esistenza di molteplici tecniche di produzione di geni sintetici. Tuttavia, tutte le tecniche prendono in prestito dal processo di produzione genetica nativa di un organismo vivente come base per la produzione chimica del gene, con lievi modifiche qua e là.
Pertanto, comprendere il processo di sintesi genetica di base aiuta ad apprezzare le sfumature delle tecniche di sintesi genetica. Di seguito è riportata una panoramica delle fasi coinvolte nella sintesi genetica.
Gli oligonucleotidi sono brevi filamenti di acido nucleico (DNA o RNA) e funzionano come elementi costitutivi per qualsiasi produzione di prodotti genici, inclusa la sintesi di peptidi e proteine. Diversi metodi di sintesi genetica impiegano diversi reagenti e tecniche per avviare la sintesi degli oligonucleotidi. Tuttavia, il processo si muove in una direzione da 3' a 5' in tutti i metodi.
La ricottura comporta il riscaldamento di molecole come gli oligonucleotidi prima di raffreddarle gradualmente per facilitare l'ibridazione o la formazione di un legame chimico tra due molecole. Diversi metodi di sintesi genetica utilizzano tecniche di annichilazione uniche per formare una sequenza genetica completa.
La clonazione comporta la replicazione di copie della sequenza genetica appena formata utilizzando un vettore di clonazione.
La sintesi genetica non è un processo perfetto. Pertanto, lo screening dei cloni è necessario per identificare il gene bersaglio all'interno dei cloni. Gli strumenti di screening più diffusi includono i kit ELISA e la cromatografia.
Oltre all'identificazione del gene bersaglio, è necessaria un'analisi approfondita delle coppie di basi nella sequenza. Inoltre, misure correttive per correggere gli errori di replicazione come la cancellazione e la sostituzione delle basi garantiscono il posizionamento auspicabile del plasmide.
Di seguito è riportata una panoramica dei metodi e delle applicazioni di sintesi genetica più popolari.
La sintesi in fase solida è un classico metodo di sintesi genetica e prevede l'utilizzo di nucleosidi chimicamente modificati, inclusi gli acidi nucleici bloccati (LNA), per sintetizzare gli oligonucleotidi bersaglio. Una colonna di reagenti contenente un acido debloccante trattiene i nucleosidi che gradualmente formano una catena oligonucleotidica con la deprotezione dei nucleosidi successivi.
Il processo di assemblaggio enzimatico comporta il sbloccaggio (deprotezione) dei nucleosidi, seguito da accoppiamento, tappatura e ossidazione per formare una sequenza genetica dagli oligonucleotidi appena formati. La sintesi in fase solida è un processo completamente automatizzato e i ricercatori raccolgono i geni alla fine. I suoi vantaggi includono una precisione della sequenza genetica notevolmente elevata.
Tuttavia, il processo di deprotezione aumenta le possibilità di reazioni collaterali e i rischi aumentano con l’aumentare della durata. Pertanto, la sintesi in fase solida produce solo geni di 15-25 basi di lunghezza (massimo 200 residui nucleotidici). Tali geni hanno applicazioni nella biologia molecolare e nella medicina, anche come antisenso nella sintesi proteica o come sonde per rilevare materia genetica complementare.
La sintesi del DNA basata su chip è un processo di sintesi genetica di nuova generazione. A differenza della sintesi in fase solida, che è un processo chimico, la sintesi basata su chip è un processo elettrochimico.
Il metodo utilizza chip semiconduttori microarray dotati di controlli della temperatura per generare più oligonucleotidi all'interno di un'unica impostazione. La sintesi basata su chip integra il tradizionale processo chimico del ciclo della fosforamidite creando sacche di zone a temperatura controllata chiamate pozzi/isole virtuali, facilitando la selettività.
Inoltre, facilita il rilevamento e la correzione degli errori durante il processo di assemblaggio dell'oligonucleotide e non richiede un'analisi della sequenza separata e una fase di correzione degli errori. I vantaggi della sintesi basata su chip includono un'elevata produttività e la capacità di generare frammenti di geni con coppie di basi più lunghe. La tecnica produce sequenze genetiche per applicazioni che richiedono un volume di DNA target elevato e una bassa precisione.
La sintesi genetica della PCR (reazione a catena della polimerasi) è un processo classico che produce milioni di frammenti genetici in due fasi che utilizzano primer. La prima fase consiste nell'assemblare nucleotidi sovrapposti attraverso una reazione a catena autoadescante per generare un oligonucleotide da 60 bp, che copre l'intera sequenza.
In secondo luogo, una successiva reazione PCR genera frammenti di DNA lunghi 400-500 bp. Un primer aggiuntivo amplifica il frammento di DNA bersaglio. Il metodo è ideale per applicazioni che richiedono frammenti genici lunghi e ad alta precisione.
La sintesi genica derivata da array è probabilmente il processo di produzione genetica più conveniente grazie al basso consumo di reagenti. In secondo luogo, il metodo consente una capacità multiplex, producendo da migliaia a decine di migliaia di sequenze oligonucleotidiche.
Tuttavia, sebbene le diverse sequenze di oligonucleotidi siano un vantaggio, l'assemblaggio degli oligonucleotidi in frammenti genici vitali è impegnativo a causa dell'omologia delle sequenze. Pertanto, il metodo è ideale per processi di sintesi genetica personalizzata che richiedono quantità molto inferiori di frammenti genetici.
Anche la sintesi genica in fase liquida è una tecnica classica, simile in molti elementi alla sintesi in fase solida. Tuttavia, a differenza della sintesi in fase solida, la generazione di oligonucleotidi avviene in una soluzione anziché nel supporto della colonna. Inoltre, la sintesi genica in fase liquida presenta un rischio inferiore di reazione a catena laterale e può generare lunghi frammenti di DNA con errori minimi, anche se più lentamente.
Le tecniche di sintesi genetica sono in continua evoluzione per soddisfare la crescente domanda di geni di alta qualità, rapporto costo-efficacia e scalabilità. I metodi evidenziati sopra sono i metodi primari di produzione genetica e puoi consultare il tuo fornitore di servizi sul metodo ideale per il tuo progetto e budget.
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