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La produzione o sintesi chimica dei geni è un pilastro fondamentale della moderna biologia molecolare, poiché contribuisce alla produzione di geni nativi completi e di geni nuovi (quelli che non si trovano in natura). Inoltre, il processo è la base per la produzione di interi genomi (l'insieme completo di istruzioni genetiche presenti in una cellula vivente).
I progressi nelle di sintesi genetica hanno reso disponibili diversi metodi di produzione genica per gli interessati. Tuttavia, ogni metodo ha la sua nicchia di applicazione, sintetizzando geni specifici, e una tecnica non può sostituirne un'altra. Pertanto, di seguito è riportata una panoramica delle tecniche di sintesi genica più comuni e delle loro caratteristiche, per orientare la scelta del metodo per diversi progetti.
La produzione di geni sintetici è un processo graduale che facilita la produzione di un gene e di altri prodotti genici senza ricorrere a un modello di DNA. Pertanto, facilita la produzione di geni diversi, inclusi geni personalizzati con sequenze o coppie di basi modificate.
Come affermato in precedenza, i progressi della biotecnologia hanno reso disponibili molteplici tecniche di produzione genica sintetica. Tuttavia, tutte queste tecniche prendono spunto dal processo di produzione genica nativa di un organismo vivente come base per la produzione chimica di geni, con lievi modifiche qua e là.
Pertanto, comprendere il processo di sintesi genica di base aiuta a comprendere le sfumature delle diverse tecniche di sintesi genica. Di seguito è riportata una panoramica dei passaggi coinvolti nella sintesi genica.
Gli oligonucleotidi sono brevi filamenti di acido nucleico (DNA o RNA) e fungono da elementi costitutivi per la produzione di qualsiasi prodotto genico, inclusa la sintesi di peptidi e proteine. Diversi metodi di sintesi genica impiegano reagenti e tecniche differenti per avviare la sintesi degli oligonucleotidi. Tuttavia, il processo si muove in direzione 3'-5' in tutti i metodi.
La ricottura comporta il riscaldamento di molecole come gli oligonucleotidi prima di raffreddarle gradualmente per facilitare l'ibridazione, ovvero la formazione di un legame chimico tra due molecole. Diversi metodi di sintesi genica impiegano tecniche di annichilazione uniche per formare una sequenza genica completa.
La clonazione comporta la replicazione di copie della sequenza genica appena formata mediante un vettore di clonazione.
La sintesi genica non è un processo perfetto. Pertanto, lo screening dei cloni è necessario per identificare il gene bersaglio all'interno dei cloni. Gli strumenti di screening più diffusi includono i kit ELISA e la cromatografia.
Oltre all'identificazione del gene bersaglio, è necessaria un'analisi approfondita delle coppie di basi nella sequenza. Inoltre, misure correttive per correggere errori di replicazione come la delezione e la sostituzione di basi assicurano il posizionamento ottimale del plasmide.
Di seguito è riportata una panoramica dei metodi e delle applicazioni di sintesi genetica più diffusi.
La sintesi in fase solida è un metodo classico di sintesi genica e prevede l'utilizzo di nucleosidi chimicamente modificati, inclusi gli acidi nucleici bloccati (LNA), per sintetizzare gli oligonucleotidi bersaglio. Una colonna di reagente contenente un acido debloccante contiene i nucleosidi che formano gradualmente una catena oligonucleotidica con la deprotezione dei nucleosidi successivi.
Il processo di assemblaggio enzimatico prevede lo sblocco (deprotezione) dei nucleosidi, seguito da accoppiamento, capping e ossidazione per formare una sequenza genica a partire dagli oligonucleotidi appena formati. La sintesi in fase solida è un processo completamente automatizzato e i ricercatori raccolgono i geni alla fine. I suoi vantaggi includono un'accuratezza della sequenza genica notevolmente elevata.
Tuttavia, il processo di deprotezione aumenta le probabilità di reazioni collaterali, e i rischi aumentano con l'aumentare della lunghezza. Pertanto, la sintesi in fase solida produce solo geni di lunghezza compresa tra 15 e 25 basi (massimo 200 residui nucleotidici). Tali geni trovano applicazioni in biologia molecolare e medicina, ad esempio come antisenso nella sintesi proteica o come sonde per il rilevamento di materiale genetico complementare.
La sintesi del DNA basata su chip è un processo di sintesi genetica di nuova generazione. A differenza della sintesi in fase solida, che è un processo chimico, la sintesi basata su chip è un processo elettrochimico.
Il metodo utilizza chip semiconduttori microarray dotati di controlli di temperatura per generare più oligonucleotidi in un'unica configurazione. La sintesi basata su chip integra il tradizionale processo chimico del ciclo fosforamidite creando sacche di zone a temperatura controllata chiamate pozzi/isole virtuali, facilitando la selettività.
Inoltre, facilita il rilevamento e la correzione degli errori durante il processo di assemblaggio degli oligonucleotidi e non richiede una fase separata di analisi della sequenza e correzione degli errori. I vantaggi della sintesi basata su chip includono un'elevata produttività e la capacità di generare frammenti genici con coppie di basi più lunghe. La tecnica produce sequenze geniche per applicazioni che richiedono un elevato volume di DNA target e una bassa accuratezza.
La sintesi genica tramite PCR (reazione a catena della polimerasi) è un processo classico che produce milioni di frammenti genici in due fasi utilizzando primer. La prima fase consiste nell'assemblare nucleotidi sovrapposti attraverso una reazione a catena autoinnescante per generare un oligonucleotide di 60 bp, che copre l'intera sequenza.
In secondo luogo, una successiva reazione di PCR genera frammenti di DNA lunghi 400-500 bp. Un primer aggiuntivo amplifica il frammento di DNA bersaglio. Il metodo è ideale per applicazioni che richiedono frammenti genici lunghi e ad alta precisione.
La sintesi genica derivata da array è probabilmente il processo di produzione genica più conveniente, grazie al basso consumo di reagenti. In secondo luogo, il metodo consente una capacità multiplex, producendo da migliaia a decine di migliaia di sequenze oligonucleotidiche.
Tuttavia, sebbene la diversità delle sequenze oligonucleotidiche rappresenti un vantaggio, l'assemblaggio degli oligonucleotidi in frammenti genici vitali è complesso a causa dell'omologia di sequenza. Pertanto, il metodo è ideale per processi di sintesi genica personalizzati che richiedono quantità molto inferiori di frammenti genici.
Anche la sintesi genica in fase liquida è una tecnica classica, simile in molti elementi alla sintesi in fase solida. Tuttavia, a differenza della sintesi in fase solida, la generazione di oligonucleotidi avviene in soluzione anziché su un supporto a colonna. Inoltre, la sintesi genica in fase liquida presenta un rischio inferiore di reazione a catena laterale e può generare lunghi frammenti di DNA con errori minimi, sebbene più lenti.
Le tecniche di sintesi genetica sono in continua evoluzione per soddisfare la crescente domanda di geni di alta qualità, economicità e scalabilità. I metodi sopra evidenziati sono i principali metodi di produzione genica e potete consultare il vostro fornitore di servizi per trovare il metodo più adatto al vostro progetto e al vostro budget.
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